详述Pcr仪的四大分类及常见问题解答

详述Pcr仪的4大分类及常见问题解答
PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶进行专1性的连锁复制。目前经常使用的技术，可以将1段基因复制为原来的1百亿至1千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪4类。
普通PCR仪
1般把1次PCR扩增只能运行1个特定退火温度的PCR仪，称之为普通PCR仪。如果要用它做不同的退火温度则需要屡次运行。主要是用作简单的，对目的基因退火温度的扩增。
主要利用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。
梯度PCR仪
1次性PCR扩增可以设置1系列不同的退火温度条件（通常12种温度梯度）的称之为梯度PCR仪。由于被扩增的不同的DNA片断其合适的退火温度不同，通过设置1系列的梯度退火温度进行扩增，从而1次性PCR扩增就能够挑选出表达量高的合适退火温度进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样既节俭时间，也节俭经费。在不设置梯度的情况下亦可当作普通的PCR用。正真的梯度，是每排管都有精确的加热控温探头，2009年为止只有美国ABI公司可以做到。其他的都是从两头的热传递来设计控温。
梯度PCR仪多利用于科研、教学机构。
原位PCR仪
（有些品牌的PCR仪具有普通PCR、梯度PCR、原位PCR的功能，通过替换模块进行多用处展开实验工作）
是用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪。如病原基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用铸造试验仪器位置等。可保持细胞或组织的完全性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置进行基因扩增。不但可以检测到靶DNA，还能标出靶序列在细胞内的位置。于份子和细胞水平上研究疾病的病发机理和临床进程及病理的转变有侧重大的实用价值。
实时荧光定量PCR仪
在普通PCR仪设计基础上增加荧光信号激起和收集系统和计算机分析处理系统，构成了具有荧光定量PCR功能的仪器。其PCR扩增原理和普通PCR扩增原理相同，在PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号收集系统实时收集信号连接输送到计算机分析处理系统，得出量化的实时结果输出。
荧光定量PCR仪有单通道，双通道和多通道之分。当只用1种荧光探针标记的时候，选用单通道；有多种荧光标记的时候使用多通道。单通道也能够检测多荧光的标记和目的基因表达产物，由于1次只能检测1种目的基因的扩增量，需屡次扩增才能检测完不同的目的基因片断的量。多通道利于做多重PCR，实现1次检测多种目的基因的功能。
实时荧光定量PCR仪主要利用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业、科研院校等。
PCR仪常见问题及回答
1. cDNA产量的很低可能的缘由：*RNA模板质量低*对mRNA浓度估计太高*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足*同位素磷32过期*反应体积过大，不应超过50μl2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅*多见的缘由在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系*与反应起始时RNA的总量及纯度有关*建议在实验中加入对比RNA*第1链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10*建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第1链合成。由于RNA模板存在2级结构，如环状结果，有可能致使GSP没法与模板退火；或SSⅡ反转录酶没法从此引物进行有效延伸。*目的mRNA中含有强的转录中断位点，可以试用以下方法解决：a. 将第1链的反应温度提高至50℃。b. 使用随机6聚体代替Oligo(dT)进行第1链反应。3. 产生非特异性条带*用RT阴性对比检测是不是被基因组DNA污染。如果RT阴性对比的PCR结果也显示一样条带，则需要用DNase I重新处理样品。*在PCR反应中，非特异的起始扩增将致使产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，下降镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。*由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将致使产生不同的RT-PCR结果。
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