荧光定量PCR检测

荧光定量原理：

荧光定量PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。随着PCR 反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，结合相应的软件对产物进行分析，可以得到荧光扩增曲线，计算待测样品初始模版的量。

应用：

实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的飞跃，运用该项技术，可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。

服务内容：

1. 客户提供样品及检测基因信息

2. 样品抽提及反转录

3. 引物及探针设计

4. 标准品构建（针对绝对定量）

5. PCR反应条件优化及引物验证

6. PCR上机正式实验

7. 实验数据分析及GraphPad专业绘图软件绘制柱状图

交付内容：

提供数据及实验报告，包括实验方法、步骤、所用试剂、仪器、RNA电泳图片、扩增曲线、溶解曲线及GraphPad专业绘图软件绘制柱状图。

业务范围：SYBR-Green染料法对DNA/RNA进行实时荧光定量PCR检测，包括mRNA、miRNA和DNA的相对和绝对定量分析。

相对定量：通过2－ΔΔCt法计算比较目的基因的表达差异。

绝对定量：需要先制备标准质粒进行等比例稀释，与待测目的基因同时进行PCR，通过比对标准曲线计算出样品中特定基因的拷贝数、摩尔数或者微克数等。

Western Blot检测

原理：

WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到硝酸纤维素薄膜上，以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以硝酸纤维素薄膜上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白。

应用：

通过抗原抗体反应对目标蛋白的表达进行半定量检测，还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析。

服务内容：

1. 配置胶

2. 样品处理，蛋白抽提定量

3. SDS-PAGE电泳

4. 转膜

5. 免疫学检测

6. 图片分析，整理报告

交付内容：

交付实验报告包括实验方法、所用试剂、仪器及曝光结果（扫描图）。

业务范围：总蛋白、磷酸化蛋白

单克隆抗体生产

大规模单克隆抗体生产：目前主要有两种方式，一是腹水制备法，另一种是转瓶培养法。

腹水制备法：将杂交瘤细胞株进行体外培养至一定浓度，再将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔中，产生腹水，从腹水中春华单克隆抗体。每只小鼠可以产生3~8ml腹水，抗体含量可以达到1~10mg/ml。腹水制备的周期为3~4周。腹水制备法具备成本低、产量高，时间快等优点，是目前主要的大规模看题生产方式。

转瓶培养法：将杂交瘤细胞进行大规模体外培养，从培养基中纯化抗体。抗体含量可以达到20~80ml/L。转瓶制备法具有抗体品质高、不含小鼠杂蛋白，不含动物病毒等优点。

客户提交样本：

1、杂交瘤细胞活力至少大于80%的杂交瘤细胞株

2、杂交瘤细胞培养基品牌、货号、配制方法

交付结果：

1、纯化好的单克隆抗体，纯度90%以上

2、最终纯化实验报告，其中报告纯化SDS-PAGE图和终浓度QC图

多克隆抗体制备

多克隆抗体存在于免疫动物的血清中，可以从血清中纯化获得。多克隆抗体能识别多个抗原位点，可用于多种免疫学反应，并且制备时间短，成本低，因此被广泛应用于免疫学研究领域和免疫学诊断领域。

服务内容

1、抗原的制备

多肽抗原合成→蛋白抗原制备→其他抗原制备

2、免疫

我们提供经过优化和验证的免疫方案，也可以根据客户的要求进行免疫。

3、抗血清的生产

4、抗体的纯化

ProteinA/G纯化、特异性亲和纯化

交付结果：

1、提供的多克隆抗体制备服务，多克隆的抗体的效价达到1：:16000以上

2、对于蛋白抗原的多克隆抗体，保证western blot检测结果为阳性。蛋白抗原的纯度大于85%。

磷酸化抗体定制服务

磷酸化抗体具体特异性识别磷酸化氨基酸的位点，可以确定蛋白质是否磷酸化，对于磷酸化蛋白可进行定性及定量分析。

磷酸化多克隆抗体制备流程：

1、磷酸化多肽的设计合成

2、合成多肽与载体蛋白偶联

3、动物免疫、抗血清制备

4、抗体的纯化及特异性亲和纯化

5、效价检测

磷酸化单克隆抗体制备流程：

1、磷酸化多肽的设计合成

2、合成多肽与载体蛋白偶联

3、动物免疫与检测

4、细胞融合

5、筛选单克隆细胞株

6、效价检测