鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/96S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

脯氨酸是植物體內(nèi)適應(yīng)逆境脅迫的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同，分為谷氨酸( Glu) 和鳥(niǎo)氨酸( Orn) 兩條合成途徑。鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶( δ-OAT) 是 是以鳥(niǎo)氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關(guān)鍵酶，對(duì)植物適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用。

測(cè)定原理：

鳥(niǎo)氨酸和α-酮戊二酸在鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶和 NADH 作用下發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成吡咯啉-5-羧酸（P5C），同時(shí)產(chǎn)生NAD，通過(guò)檢測(cè) 340nm 處的吸光度的變化可反映出鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的高低。

組成：

試劑二臨用前加 8ml 試劑一充分溶解；用不完的試劑 4℃保存。試劑三臨用前加 8ml 試劑一充分溶解；用不完的試劑 4℃保存。試劑四臨用前每瓶加 4ml 試劑一充分溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用。

自備儀器和用品：

天平、低溫離心機(jī)、研缽、酶標(biāo)儀、96 孔板。

酶液提?。?/span>

1、組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1ml 提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 4℃，10000g離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。 3、液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作：

1、酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm。

2、將配好的試劑二、三、四 37℃預(yù)熱 5min。（注意：粉劑試劑需要自行配制）

3、取 96 孔板，依次加入 60μl 試劑二，60μl 試劑三，60μl 試劑四，20μl 粗酶液，充分混勻，記錄 340nm

處初始吸光值和 37℃反應(yīng) 10min 的吸光值A2，△A=A1-A2。

計(jì)算公式：

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 δ-OAT（nmol/min /mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 δ-OAT（nmol/min /g 鮮重）=ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷W

（3） 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 δ-OAT（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

（4） 按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 δ-OAT（nmol/min /ml）＝ΔA÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T

=321.54×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑， 0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g