分子診斷是以 DNA、RNA 或蛋白質(zhì)分子為診斷材料，通過檢查人體內(nèi)源基因或外源(病原體）基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體狀態(tài)或疾病作出特異性診斷的方法和過程。分子診斷技術(shù)主要是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction簡(jiǎn)稱PCR）、原位雜交FISH、基因芯片和基因測(cè)序技術(shù)，與雜交、高通量測(cè)序技術(shù)相比，PCR技術(shù)主要優(yōu)勢(shì)在于靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單且易于推廣，在檢測(cè)基因數(shù)量上有一定的局限性，但從短期來看，PCR技術(shù)仍將是分子診斷的主流技術(shù)。

翌圣生物在酶原料領(lǐng)域深耕多年，長(zhǎng)期為IVD企業(yè)、第三方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)、科研機(jī)構(gòu)等提供高品質(zhì)、高性價(jià)比的分子診斷PCR原料，包括逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase 抑制劑、Taq DNA 聚合酶、尿嘧啶糖基化酶（UDG/UNG酶）、taq酶抗體、dNTPs等單組份以及經(jīng)過體系優(yōu)化的qPCR/RT-qPCR預(yù)混液，可為臨床/非臨床診斷試劑盒開發(fā)提供性能優(yōu)、穩(wěn)定的酶原料。

分子診斷PCR擴(kuò)增工作流程及原料一覽

一、核心酶原料-Taq DNA聚合酶

隨著應(yīng)用檢測(cè)領(lǐng)域的拓展和市場(chǎng)需求的提升，野生型Taq DNA聚合酶已不能滿足需求，翌圣ZymeEditorTM酶改造平臺(tái)針對(duì)不同的應(yīng)用需求，定向改造了Taq DNA 聚合酶，推出一系列適合全預(yù)混、耐抑制、超潔凈等匹配不同應(yīng)用方向的熱啟動(dòng)Taq DNA 聚合酶。

• 優(yōu)yue的穩(wěn)定性：配制成含引物探針的全預(yù)混液，37℃ 7天處理后，低濃度檢出無變化

圖1：以HBV核酸為模板，使用10726ES配制成qPCR全預(yù)混液，除模板外所有體系在37℃下放置7天測(cè)試加速穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：高、中、低濃度Ct值和熒光值無顯著變化，表明以10726ES配制的預(yù)混液性能穩(wěn)定。

• 宿主gDNA殘留低：E. coli基因組DNA殘留＜0.5 copies/ 100 U

圖2：E. coli基因組線性范圍：30 fg/μL-300 pg/μL，相關(guān)性R2=0.9999。(B) 三批次Hieff UCF.ME® Sensitive Taq DNA Polymerase的E. coli基因組DNA殘留＜0.5 copies/ 100 U。

二、核心酶原料-逆轉(zhuǎn)錄酶

作為RT-qPCR反應(yīng)的關(guān)鍵原料之一，逆轉(zhuǎn)錄酶需要具備更快的逆轉(zhuǎn)錄速度、更高的合成產(chǎn)量以及更好的耐熱性能。為了獲得更適用于RT-qPCR的逆轉(zhuǎn)錄酶，翌圣生物在M-MLV的基礎(chǔ)上通過基因改造，開發(fā)出RNaseH活性更低，熱穩(wěn)定性更高，持續(xù)合成能力更強(qiáng)的Hifair®系列逆轉(zhuǎn)錄酶。

• 可耐受58℃反應(yīng)溫度，適合復(fù)雜RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄

圖3：將Hifair® V Reverse Transcriptase及進(jìn)口品牌T*的逆轉(zhuǎn)錄酶分別在55℃及58℃下孵育30min檢測(cè)殘余酶活。結(jié)果顯示Hifair® V Reverse Transcriptase在58℃下孵育30min仍能保持70%活性，遠(yuǎn)超進(jìn)口品牌。

• 應(yīng)用于RT-qPCR檢出率優(yōu)于其他品牌，檢出范圍：1 pg-1 μg

圖4：以1 pg-1 μg（7個(gè)梯度）的293T細(xì)胞總RNA為模板，使用Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR(Cat#11142)、V*、T*進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA進(jìn)行qPCR定量分析。結(jié)果顯示，11142ES靈敏度可達(dá)1 pg，檢出率優(yōu)于競(jìng)品。

三、其他酶及酶抑制劑：RNase抑制劑、UDG酶

翌圣提供多種歷經(jīng)IVD工業(yè)應(yīng)用驗(yàn)證的酶、RNase 酶抑制劑、Taq酶抗體等原料產(chǎn)品，為廣泛的體外診斷產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)提供豐富的高品質(zhì)原料解決方案，相關(guān)酶類等產(chǎn)品在保護(hù)分子檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物中廣泛應(yīng)用。

RNase 酶抑制劑：翌圣以可溶形式在大腸桿菌中表達(dá)純化的重組鼠源/豬源RNase抑制劑，能夠廣泛抑制各種類型RNase(RNase A, B, C)，并且該抑制劑不會(huì)抑制聚合酶的活性，已驗(yàn)證可廣泛應(yīng)用于RT-PCR/qPCR、RNA-seq、cDNA克隆和文庫(kù)構(gòu)建等多個(gè)應(yīng)用場(chǎng)景。除了常規(guī)RNase抑制劑，還開發(fā)了經(jīng)過UCF.ME®超低殘留工藝處理，宿主殘留更低，適合對(duì)背景菌要求更為嚴(yán)格的應(yīng)用場(chǎng)景的RNase抑制劑，助力解決病原檢測(cè)中的背景菌干擾，提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。

UDG酶：尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），與dUTP搭配使用，可建立PCR防污染體系，翌圣研發(fā)的熱敏、低殘留UDG酶，可避免常規(guī)UDG酶滅活后可能存在的殘留活性在常溫下對(duì)含dU擴(kuò)增產(chǎn)物的降解作用，同時(shí)防止分子酶中存在的背景菌造成PCR結(jié)果假陽性，對(duì)于準(zhǔn)確鑒別感染病原體，協(xié)助感染、傳染病的臨床診斷至關(guān)重要。

Taq酶抗體：非特異性擴(kuò)增是顯著影響PCR性能的主要問題之一，熱啟動(dòng)技術(shù)可以有效減少非特異擴(kuò)增?？贵w修飾的熱啟動(dòng)酶封閉效率高，效果佳，室溫下穩(wěn)定，酶活釋放速度快，翌圣生物開發(fā)的熱啟動(dòng)Taq酶雙封閉抗體不僅可以封閉Taq酶的5'→3'聚合酶活性，還能同時(shí)封閉Taq酶的5'→3'外切酶活性，雙管齊下，既能有效防止錯(cuò)配或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，又能防止探針或引物降解產(chǎn)生非特異信號(hào)，雙重提升試劑的穩(wěn)定性。

四、通用高性能全預(yù)混qPCR預(yù)混液

翌圣生物提供高品質(zhì)qPCR試劑，高性能的熱啟動(dòng)Taq酶搭配優(yōu)化的緩沖體系，可提供包括通用型預(yù)混液，全預(yù)混預(yù)混液，基因分型預(yù)混液，可凍干預(yù)混液等，具有使用簡(jiǎn)便、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)，加快您的分子診斷產(chǎn)品開發(fā)。

• 試劑通用性好：適配多類型多重引探（已驗(yàn)證超40種不同類型靶標(biāo)），具有優(yōu)秀的擴(kuò)增性能；

• 強(qiáng)全預(yù)混穩(wěn)定性：37℃可放置14天，4℃可放置28天，反復(fù)凍融50次性能穩(wěn)定；

• 靈敏度高特異性好：靈敏度可檢測(cè)到0.25 copy/μL，特異性48孔陰性不起峰；

• 支持快速程序：兼容快速程序，30min即可出結(jié)果；

• dUP/UDG防污染體系：引入了dUTP/UDG防污染系統(tǒng)，可有效防止氣溶膠污染；

• 多平臺(tái)多體系適用： Bio-Rad CFX96、ABI Q5、7500、Slan、天隆等均適配。

圖5：基于全預(yù)混試劑穩(wěn)定性考察，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組試劑的Ct值偏差(△Ct值)在±0.5以內(nèi)，熒光值偏差在15%以內(nèi)，翌圣全預(yù)混試劑具有優(yōu)秀的多重?cái)U(kuò)增穩(wěn)定性能。

對(duì)16710ES分別進(jìn)行三種方式處理(4℃、37℃以及凍融)。實(shí)驗(yàn)組于4℃、37℃分別處理7天，凍融50次，與對(duì)照組(-20℃保存)在4組多重?cái)U(kuò)增體系（組1、組2及組4為4重?cái)U(kuò)增體系，組3為3重?cái)U(kuò)增體系）下進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)評(píng)。

五、通用高靈敏RT-qPCR預(yù)混液

一步法RT-qPCR試劑整合逆轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動(dòng)酶的優(yōu)性能，配合優(yōu)化的緩沖體系，可實(shí)現(xiàn)個(gè)位數(shù)拷貝模板的快速靈敏檢測(cè)，經(jīng)過呼吸道疾病、動(dòng)物疫病、科研體系等各類客戶市場(chǎng)驗(yàn)證，可滿足各種應(yīng)用方向的需求。

• 通用性強(qiáng)：適用病原微生物、人源基因組、植物等多物種的核酸進(jìn)行qPCR擴(kuò)增、檢測(cè)；

• 優(yōu)異的擴(kuò)增靈敏度：精心優(yōu)化的緩沖體系，提高了低濃度模板的檢測(cè)靈敏度，可高達(dá)250 copies/mL；

• dUTP/UDG 防污染系統(tǒng)：引入 dUTP/ Heat-labile UDG 防污染系統(tǒng)，高效降解產(chǎn)物的氣溶膠污染，降低假陽性，確保結(jié)果真實(shí)可信；

• 支持快速程序：兼容快速程序，40 min內(nèi)完成結(jié)果檢測(cè)；

• 優(yōu)異的儲(chǔ)存穩(wěn)定性：37℃放置14天、反復(fù)凍融10次試劑性能穩(wěn)定。

圖6：使用翌圣RT-qPCR預(yù)混合（16630ES）和市面上同類產(chǎn)品Supplier-A，同時(shí)檢測(cè)4個(gè)病原靶標(biāo)（副流感病毒HPIV2、副流感病毒HPIV4、呼吸道合胞病毒HRVA和鼻病毒RSVA），結(jié)果顯示16630ES檢測(cè)靈敏度高于supplier-A。

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