一、檢測原理
本試劑盒采用 ELISA 雙抗體夾心法原理。用純化的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 抗體包被微孔板，向已包被板微孔中依次加入標準品及待測樣本，同時加入 HRP 標記的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 抗體，形成抗體 - 抗原 - 酶標檢測抗體復(fù)合物，經(jīng)過洗滌后加入底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 呈正相關(guān)。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光值（OD 值），通過繪制標準曲線計算樣品中 SARS-CoV-2 Nucleoprotein 濃度。
二、試劑盒組成
試劑盒組成 | 規(guī)格（96T） | 保存條件 |
抗體包被板條 | 8×12 | 2 - 8℃保存 |
標準品 | 1 ml×2 瓶 | 2 - 8℃保存 |
S1 標準品 / 樣本稀釋液 | 15 ml×1 瓶 | 2 - 8℃保存 |
檢測抗體濃縮液（100×） | 30μl×2 瓶 | 2 - 8℃保存 |
S2 檢測抗體稀釋液 | 15ml×1 瓶 | 2 - 8℃保存 |
濃縮洗滌液（20×） | 30ml×1 瓶 | 2 - 8℃保存 |
顯色底物（避光） | 12ml×1 瓶 | 2 - 8℃保存 |
終止液 | 6ml×1 瓶 | 2 - 8℃保存 |
封板膠紙 | 4 張 | |
說明書 | 1 份 |
三、其它實驗材料（不提供，但可協(xié)助購買）
1. 酶標儀 (主波長 450nm，參考波長 630nm)
2. 高精度可調(diào)移液器（已校準）及吸頭：0.5 - 10,2 - 20,20 - 200,200 - 1000μl。一次檢測樣本較多時，建議使用多通道移液器。
3. 自動洗板機或洗瓶
4. 微量振蕩器
5. 雙蒸水或去離子水
6. 坐標紙
7. 量筒
四、注意事項
8. 試劑盒保存在 2 - 8℃，未用完的標準品，建議丟棄。不可混合使用不同來源或不同批號的試劑盒組分，請在有效期內(nèi)使用本產(chǎn)品。
9. 濃縮洗滌液低溫取出可能會伴有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加熱助溶，不影響使用。
10. 各步加樣均應(yīng)使用移液器，并經(jīng)過校準，以免產(chǎn)生誤差。建議一次加樣時間最好控制在 5 分鐘內(nèi)，如樣本數(shù)量較多，推薦使用排槍加樣。
11. 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復(fù)孔。如樣本中待測物質(zhì)含量高于試劑盒檢測上限（樣本 OD 值大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣本稀釋液稀釋一定的倍數(shù)（n 倍）后再測定，計算時需乘以總稀釋倍數(shù)。
12. 為避免交叉污染，在加入不同濃度的標準品、不同樣本、不同試劑時謹記及時更換吸頭，封板膠紙只限一次性使用。
13. 濃縮酶結(jié)合物及顯色底物請避光保存，顯色底物在添加之前，應(yīng)保持無色，請勿使用已變?yōu)樗{色的顯色底物。
14. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準。
五、樣本收集、處理及保存方法
15. 細胞上清液：將培養(yǎng)基移至離心管內(nèi)，于 4℃下，1500rpm 離心 10 分鐘，取上清進行分裝并在 - 80℃下保存樣品，盡可能減少反復(fù)凍融次數(shù)。
16. 細胞提取物：吸取培養(yǎng)基并用預(yù)冷 PBS 洗滌細胞一次，吸出 PBS，在 100 mm 培養(yǎng)板加入 0.5ml 提取緩沖液。收集細胞至經(jīng)過預(yù)冷的離心管中，短暫渦旋后在冰上孵育 15 - 30 分鐘，于 4℃下 13000rpm 離心 10 分鐘，將上清液（這里是指可溶性細胞提取物）分裝至預(yù)冷的離心管中，并于 - 80℃保存，盡可能減少反復(fù)凍融次數(shù)。
提取緩沖液：100 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EGTA、1 mM EDTA、1% Triton X - 100、0.5% 脫氧膽酸鈉、磷酸酶抑制劑混合物、蛋白酶抑制劑混合物、PMSF。
17. 若樣本無法立即檢測，請將其按最小使用量分裝， - 20℃ — - 80℃保存，避免反復(fù)凍融。如果樣本中含有大量顆粒，檢測前先離心或過濾去除；室溫下解凍，請勿于 37℃或更高的溫度加熱解凍。
18. 不能檢測含 NaN3 的樣本，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的活性。
19. 請根據(jù)實際情況，將樣本做適當倍數(shù)稀釋（建議根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果確定稀釋倍數(shù)）。
六、試劑準備
20. 試劑回溫：請在實驗前 30min 內(nèi)，將試劑盒和待測樣本置于室溫下回溫。
21. 洗滌液配制：根據(jù)濃縮洗液的濃縮倍數(shù)，用雙蒸水或去離子水進行相應(yīng)倍數(shù)稀釋后備用。
22. 標準品梯度稀釋：取出試劑盒提供的標準品（25ng/ml），然后取 5 只聚丙烯試管，各加入 500μl 標準品 / 樣本稀釋液（S1），按照以下濃度進行 2 倍稀釋：25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 ng/ml 進行稀釋。25ng/ml 為標準曲線最高點濃度，標準品 / 樣本稀釋液（S1）作為標準曲線的零點（0ng/ml）。使用過的標準品原液（25ng/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在 - 20～ - 80℃冰箱。
23. 檢測抗體工作液：根據(jù)試驗所需用量，用檢測抗體稀釋液（S2）將檢測抗體濃縮液（100×）稀釋成 1 倍應(yīng)用工作液，請于 30min 內(nèi)使用。
七、操作步驟
24. 加樣：根據(jù)試驗所需用量，取出相應(yīng)抗體包被板條，分別將已配制好的標準品、標準品零點（S1）及待測樣本以 50μl / 孔加入實驗孔底部，盡量不觸及孔壁，同時，各實驗孔加入檢測抗體工作液（50μl / 孔），充分混勻。
25. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 90 分鐘。
26. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。
27. 顯色：每孔加入 100μl 顯色底物，用封板膠紙封板后室溫顯色 10 - 20min。
28. 終止：每孔加終止液 50μl（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
29. 測定：用酶標儀 450nm 波長測定各孔的吸光度（OD 值），測定應(yīng)在加終止液后 5min 以內(nèi)進行。
八、結(jié)果判斷
30. 建議采用雙波長讀數(shù)，即每個標準品和樣本的 450nm OD 值減去 630nm OD 值，為最終數(shù)值，如果做復(fù)孔，求其平均值。
31. 使用計算機軟件以吸光度 OD 值為縱坐標 (Y)，相應(yīng)的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 標準品濃度為橫坐標 (X)，生成標準曲線，樣本的 SARS-CoV-2 應(yīng)稀釋倍數(shù)。
本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗標準品所繪標準曲線為準
九、試劑盒性能
批內(nèi)與批間差應(yīng)小于 10%
十、檢測范圍
0.78 ng/ml - 25 ng/ml
十一、靈敏度
0.4 ng/ml
十二、常見問題分析及解決辦法
問題 | 可能原因 | 解決辦法 |
無顏色 | 不同試劑盒或不同批號的試劑混合 | 重新檢查試劑的標簽，確準所有組分都屬于正使用的試劑盒中的。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。 |
漏加抗體、酶、顯色劑 | 檢查操作流程，注意不要漏加 | |
HRP 酶污染了疊氮鈉 | 使用新配制的試劑，禁含疊氮鈉 | |
試劑配制 / 使用有誤 | 重做試驗，嚴格按說明書操作，每次配制和使用前看清標簽 | |
顯色弱 | 超過有效期的產(chǎn)品可能會產(chǎn)生很弱的信號 | 檢查產(chǎn)品有效期 |
縮短孵育時間能使實驗信號變?nèi)?/span> | 檢查孵育時間 | |
使用了被污染的試劑 | 檢查試劑是否被污染 | |
儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配 | 儀器是否設(shè)定正確，濾光片的使用等 | |
洗滌操作不規(guī)范 | 洗滌不充分，使用手工洗板常出現(xiàn)，洗瓶洗滌，每孔應(yīng)充滿洗滌緩沖液，傾出時應(yīng)迅速。若用洗板機，應(yīng)校準并設(shè)定足夠充滿每孔的體積量。板內(nèi)側(cè)不應(yīng)接觸設(shè)備，檢查每孔是否有殘留的洗液或每孔加樣量的體積是否準確，可在兩次洗板之間加 30 秒的浸泡 | |
高背景 | 實驗中孵育溫度和時間不適當 | 確定每一試驗步驟的孵育溫度和時間是否適當 |
酶加量過多 | 加酶前驗看移液器調(diào)節(jié)量是否準確，檢查稀釋度，若必要進行效價測定 | |
標曲佳但樣本孔無信號 | 樣本中靶標物含量低或樣本中無靶標物 | 設(shè)置陽性對照，重復(fù)實驗 |
樣本基質(zhì)效應(yīng)影響檢測 | 重新稀釋樣本后復(fù)測 | |
標曲佳但樣本信號偏高 | 樣本中待檢物含量超過標準曲線范圍 | 重新稀釋樣本后復(fù)測 |
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