Fig 3. ADAR Reporter #2具有最佳的ADAR1響應(yīng)和選擇性。

使用三種報(bào)告基因設(shè)計(jì)，生成了HEK293 cell pool，并使用轉(zhuǎn)染ADAR1質(zhì)粒的瞬轉(zhuǎn)來(lái)篩選敏感性高，響應(yīng)強(qiáng)的細(xì)胞系。

鑒于ADAR1和ADAR2的RNA靶標(biāo)序列存在重疊，ADAR2過(guò)表達(dá)可能產(chǎn)生的影響。圖3A顯示，三種ADAR報(bào)告基因中的兩種在ADAR1過(guò)表達(dá)時(shí)觸發(fā)了熒光素酶活性。其中，ADAR Reporter #2在ADAR2表達(dá)時(shí)沒(méi)有響應(yīng)，與ADAR Reporter #1相比，ADAR Reporter #2對(duì)ADAR1具有更好的特異性（圖3B）。因此，選擇ADAR Reporter #2制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

Fig 4. 穩(wěn)轉(zhuǎn)ADAR1響應(yīng)型報(bào)告細(xì)胞系對(duì)ADAR1有響應(yīng)，對(duì)ADAR2無(wú)響應(yīng)。

從表達(dá)Reporter #2的HEK293 cell pool中選擇穩(wěn)定的、單克隆細(xì)胞系。通過(guò)瞬轉(zhuǎn)ADAR2或ADAR1的p150或p110亞型，比較熒光素酶活性。

結(jié)果表明，與p110相比，對(duì)ADAR1 p150活性的偏好響應(yīng)，ADAR2過(guò)表達(dá)時(shí)檢測(cè)到的熒光素酶活性很小。

在21代的穩(wěn)定性測(cè)試中，該細(xì)胞系一直維持的熒光素酶活性。

為了，通過(guò)將ADAR1 p150亞型通過(guò) 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到ADAR1響應(yīng)型報(bào)告HEK293細(xì)胞系中，生成ADAR1過(guò)表達(dá)HEK293細(xì)胞系，可評(píng)估ADAR1為靶點(diǎn)的化合物。

ADAR1的siRNA knockdown使熒光素酶活性減少，說(shuō)明熒光素酶活性來(lái)自ADAR1過(guò)表達(dá)（圖5B）。ADAR1 knockdown并不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性（圖5C）。因此，細(xì)胞死亡并未導(dǎo)致觀察到的熒光素酶活性降低。

將96孔板和384孔板進(jìn)行比較顯示，與對(duì)照組相比，細(xì)胞系具有強(qiáng)且穩(wěn)定的信號(hào)（圖6）。

Fig 5. ADAR1活性熒光素報(bào)告HEK293細(xì)胞系中的熒光素酶活性源于ADAR1的表達(dá)。

Fig 6. ADAR1過(guò)表達(dá)的報(bào)告基因細(xì)胞中ADAR1依賴(lài)的熒光素酶活性一致性高。

該細(xì)胞系可同時(shí)評(píng)估ADAR1活性和化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。ADAR1活性報(bào)告熒光素HEK293細(xì)胞系可穩(wěn)定、持續(xù)表達(dá)Renilla熒光素酶。Firefly和Renilla熒光素酶活性都與細(xì)胞密度相關(guān)（圖7）。

圖7. 在ADAR1活性雙熒光素酶報(bào)告基因細(xì)胞系中，F(xiàn)irefly熒光素酶和Renilla熒光素酶信號(hào)與細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。

三種細(xì)胞系可支持ADAR1研究的不同方面：

• ADAR1 Responsive Luciferase Reporter Cell Line（ #82238）可比較ADAR1修飾和突變對(duì)ADAR1活性的影響，例如研究結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系，或者研究RNA編輯的ADAR1變體。

• ADAR1 Activity Luciferase Reporter Cell Line（ #82239）穩(wěn)定表達(dá)ADAR1，適用于評(píng)估ADAR1調(diào)節(jié)劑（如小分子抑制劑）的療效。可進(jìn)行高通量篩選。

• ADAR1 Activity Two-Luciferase Reporter Cell Line（ #82240）可在評(píng)估靶向ADAR1化合物（如小分子抑制劑）的效力的同時(shí)，進(jìn)行毒性測(cè)定。

10

ADAR1相關(guān)產(chǎn)品