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示蹤細胞

前言

 動(dòng)物模型實(shí)驗是藥物研發(fā)和生物醫學(xué)研究不可或缺的手段，在新藥試驗、疾病診斷、藥物與醫療器械安全性研究等領(lǐng)域被廣泛使用，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗，可取得真實(shí)可靠的研究數據。

活體成像原理

      活體成像技術(shù)方法主要分為生物發(fā)光和熒光兩種：生物發(fā)光技術(shù)主要是用熒光素酶(Luciferase)標記細胞，而熒光技術(shù)是用熒光蛋白(如GFP,RFP等)對細胞進(jìn)行標記。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)：
 生物發(fā)光活體成像是指在小的哺乳動(dòng)物體內利用熒光素酶基因表達所產(chǎn)生的熒光素酶蛋白與其小分子底物熒光素在氧、Mg2+離子存在的條件下消耗ATP發(fā)生氧化反應，將部分化學(xué)能轉變?yōu)榭梢?jiàn)光能釋放，在體外利用敏感的CCD設備形成圖像。該方法靈敏度高，特異性強，無(wú)自發(fā)光，背景低，不需要光照激發(fā)，它也有不足之處：波長(cháng)依賴(lài)性的組織穿透能力，血紅蛋白是吸收光子的主要物質(zhì);每次成像前需要給動(dòng)物麻醉和注射熒光素酶(Luciferase)底物，會(huì )增加人力和試劑成本，底物在體內的分布與藥代動(dòng)力學(xué)會(huì )影響發(fā)光信號。常用的熒光素酶底物：
 

 

熒光活體成像技術(shù)是通過(guò)激發(fā)光將細胞標記的熒光基團激發(fā)到達高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光?？紤]到不同熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜和激發(fā)光譜不同，需要成像設備具備相應激發(fā)光源和發(fā)射濾片。該方法對設備和試劑要求較低，熒光蛋白可選擇標記多種顏色，熒光蛋白穩定性強，缺點(diǎn)是靈敏度較低，需要外源光照激發(fā)，非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比和靈敏度遠低于生物發(fā)光，激發(fā)光對動(dòng)物有一定影響。

總的來(lái)說(shuō)，現有的活體成像技術(shù)方法各有優(yōu)勢，在腫瘤相關(guān)的應用領(lǐng)域，生物發(fā)光（Luciferase）活體成像技術(shù)的使用更為廣泛，具有重要的應用價(jià)值。

示蹤細胞的構建與使用

        活體成像技術(shù)的應用過(guò)程中，示蹤細胞選擇和標記非常關(guān)鍵，示蹤細胞構建過(guò)程如下：

1. 選擇符合實(shí)驗需求和成瘤性指標的母細胞，需要采用來(lái)源正確，成瘤性良好，傳代次數較低，狀態(tài)保持良好的細胞株作為母細胞；

2. 選擇適合的標記蛋白，常用的標記蛋白有Firefly Luciferase，GFP，EGFP, RFP, YFP等；

3. 選擇標記蛋白表達載體和基因導入方式（常用慢病毒方式），篩選穩定細胞株；

4. 示蹤細胞體外發(fā)光測試，測定發(fā)光信號強度和細胞傳代信號穩定性，確保示蹤細胞在體外和體內都能穩定高水平表達標記蛋白，以科佰生物A549-Luc細胞為例：



5. 根據實(shí)驗需要通過(guò)尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等方法在動(dòng)物體內接種已標記的示蹤細胞。

6. 活體成像：動(dòng)物經(jīng)麻醉（氣麻/針麻）后放入成像暗箱平臺，開(kāi)啟照明燈（明場(chǎng)）拍攝背景圖。關(guān)閉照明燈，在沒(méi)有外界光源的條件下（暗場(chǎng)）拍攝由小鼠體內發(fā)出的特異性光子。明場(chǎng)與暗場(chǎng)的背景圖疊加后可以直觀(guān)的顯示動(dòng)物體內特異光子的部位和強度，完成成像操作。值得注意的是熒光成像需要選擇合適的激發(fā)光和發(fā)射光濾光片，生物發(fā)光則需要成像前注射luciferase底物。
7. 數據處理：動(dòng)物活體成像圖像處理軟件除了提供含有光子強度標尺的成像圖片外，還能計算分析發(fā)光面積、總光子數、光子強度的相關(guān)參數供實(shí)驗者參考。

應用介紹

 1.長(cháng)期動(dòng)態(tài)檢測腫瘤的生長(cháng)，并可建立相應的動(dòng)物模型進(jìn)行抗腫瘤藥物的篩選。動(dòng)物體內藥效實(shí)驗示例：

2.腫瘤轉移：由于活體成像技術(shù)直觀(guān)、靈敏度高的特點(diǎn)，成為研究腫瘤轉移的重要手段。動(dòng)物體內腫瘤轉移示例：

3.基因治療研究：利用標識蛋白基因分別標記病毒或細胞, 觀(guān)察標記病毒在體內對細胞的靶向識別和特異性殺傷。實(shí)驗示例：

4.CAR-T治療研究：利用標識蛋白分別標記CAR-T細胞或腫瘤細胞, 觀(guān)察CAR-T細胞在體內分布和擴增，評估對腫瘤細胞的識別和特異性殺傷效果。實(shí)驗示例：

科佰示蹤細胞株特點(diǎn)

       1. 優(yōu)質(zhì)母細胞，具備STR驗證數據

  2. 高信噪比

  3.體外高穩定性


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