功能預(yù)測分析
基于樣品中的物種組成及豐度信息推測樣品中表型類型和功能組成及差異。包含PICRUSt2功能預(yù)測、FAPROTAX功能預(yù)測、BugBase表型預(yù)測、Tax4Fun2功能預(yù)測和真菌FunGuild表型預(yù)測。
一. PICRUSt2功能預(yù)測
PICRUSt1軟件依賴于Greengene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種比對、功能數(shù)據(jù)輸出。而Greengene數(shù)據(jù)庫在2013年之后就停止了更新，距今為止已有7年。隨著時(shí)間的推移，大量微生物基因組數(shù)據(jù)測序獲得，而停止更新的Greengene數(shù)據(jù)庫限制了PICRUSt的功能預(yù)測范圍。對于近年來測序獲得微生物功能功能信息無法進(jìn)行預(yù)測，滿足不了當(dāng)前的研究需求，為了補(bǔ)上這塊滿足科研工作者的需求，PICRUSt團(tuán)隊(duì)于近期升級了軟件，正式公布了PICRUSt2。
1）將待預(yù)測的OTU代表序列置于軟件中已有的系統(tǒng)發(fā)育樹中，而不是直接對OTU序列進(jìn)行分類學(xué)注釋；
2）不再基于GreenGene 16S數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能預(yù)測，其用于預(yù)測的參考基因組數(shù)據(jù)庫相比先前也已擴(kuò)大了10倍以上
參考文獻(xiàn)：Douglas G M, Maffei V J, Zaneveld J, et al. PICRUSt2: An improved and extensible approach for metagenome inference. bioRxiv, 2019.
功能組成分析：統(tǒng)計(jì)各樣品在不同分類層級上的功能組成。
注：橫坐標(biāo)為樣品名稱；縱坐標(biāo)為功能相對豐度百分比。
功能差異分析：統(tǒng)計(jì)各樣品或者各組在不同分類層級上的功能差異。
注：圖中不同顏色代表不同的樣品或分組。左圖所示為不同功能在兩個(gè)樣品或者兩組樣品中的豐度比例，中間所示為95%置信度區(qū)間內(nèi)功能豐度的差異比例，最右邊的值為校正后p值。
二. FAPROTAX功能預(yù)測
FAPROTAX較適用于對環(huán)境樣本的生物地球化學(xué)循環(huán)過程（特別是碳、氫、氮、磷、硫等元素循環(huán)）進(jìn)行功能注釋預(yù)測。FAPROTAX是根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)手動構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫，它把原核微生物的分類和代謝等功能對應(yīng)起來，目前收集自4600多個(gè)原核微生物的80多個(gè)功能分組7600多條功能注釋信息。
參考文獻(xiàn)：Louca S, Parfrey L W, Doebeli M. Decoupling function and taxonomy in the global ocean microbiome[J]. Science, 2016, 353(6305): 1272-1277.
三. BugBase表型預(yù)測
BugBase是一種預(yù)測復(fù)雜微生物組內(nèi)功能途徑的生物水平覆蓋以及生物可解釋表型的方法。BugBase首先通過預(yù)測的16S拷貝數(shù)對OTU進(jìn)行歸一化，然后使用提供的預(yù)先計(jì)算的文件預(yù)測微生物表型。包括以下七方面：革蘭氏陽性 （Gram Positive）、革蘭氏陰性 （Gram Negative）、生物膜形成 （Biofilm Forming）、致病潛力 （Pathogenic Potential）、移動元件含量 （Mobile Element Containing）、氧的利用 （Oxygen Utilizing）、氧化脅迫耐受 （Oxidative Stress Tolerant）。
參考文獻(xiàn)：Ward T, Larson J, Meulemans J, Hillmann B, Lynch J, SidiropoulosD,Spear J, Caporaso G, Blekhman R, Knight R, Fink R, Knights D. 2017.BugBase predicts organism level microbiome phenotypes. bioRxiv.
四. Tax4Fun2功能預(yù)測
Tax4Fun全面升級為Tax4Fun2.評估微生物群落的功能和冗余度是環(huán)境微生物學(xué)的主要挑戰(zhàn)。Tax4Fun2可基于16S rRNA基因序列快速預(yù)測原核生物的功能譜和功能冗余。通過合并用戶定義的、特定于棲息地的基因組信息，可以顯著提高預(yù)測功能圖譜的準(zhǔn)確性。
優(yōu)點(diǎn)：
（1）不再局限于僅SILVA的特定版本注釋的OTU豐度表，允許直接以O(shè)TU代表序列作為輸入，通過與指定參考數(shù)據(jù)庫的比對實(shí)現(xiàn)物種注釋。除了Tax4Fun2提供的已構(gòu)建好的參考集（相比之前大幅擴(kuò)大），也允許我們提供自定義的參考集，使用非常靈活。
（2）側(cè)重于原核數(shù)據(jù)，但也可以合并真核數(shù)據(jù)。
（3）提供了計(jì)算特定功能冗余的方法，對于預(yù)測特定功能在環(huán)境擾動期間丟失的可能性至關(guān)重要。
（4）精度和穩(wěn)定性顯著提升。
參考文獻(xiàn)：Wemheuer F, Taylor J A, Daniel R, et al. Tax4Fun2: a R-based tool for the rapid prediction of habitat-specific functional profiles and functional redundancy based on 16S rRNA gene marker gene sequences. bioRxiv, 2018.
五. FunGuild表型預(yù)測
FUNGuild(Fungi Functional Guild)是一種可用于由生態(tài)協(xié)會分類學(xué)解析真菌的工具，用簡單而一致的方法將大型序列庫分類為具有生態(tài)意義的類別。根據(jù)營養(yǎng)方式將真菌分為12類，然后構(gòu)建了一個(gè)真菌分類和功能分組（guild）之間的數(shù)據(jù)庫，通過這個(gè)數(shù)據(jù)庫你就可以對真菌進(jìn)行功能分類。
病理營養(yǎng)型（pathotroph）：通過損害宿主細(xì)胞而獲取營養(yǎng)（包括吞噬型真菌phagotrophs）。
共生營養(yǎng)型（symbiotroph）：通過與宿主細(xì)胞交換資源來獲取營養(yǎng)。
腐生營養(yǎng)型（saprotroph）：通過降解死亡的宿主細(xì)胞來獲取營養(yǎng)。包括動物病原菌（animal pathogens）、叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi）、外生菌根真菌（ectomycorrhizal fungi）、杜鵑花類菌根真菌（ericoid mycorrhizal fungi）、葉內(nèi)生真菌（foliar endophytes）、地衣寄生真菌（lichenicolous fungi）、地衣共生真菌（lichenized fungi）、菌寄生真菌（mycoparasites）、植物病原菌（plantpathogens）、未定義根內(nèi)生真菌（undefined root endophytes）、未定義腐生真菌（undefined saprotrophs）和木質(zhì)腐生真菌（wood saprotrophs）。
參考文獻(xiàn)：Nguyen NH, Song Z, Bates ST, Branco, S, Tedersoo L, Menke J, Schilling JS, Kennedy PG. 2016. FUNGuild: an open annotation tool for parsing fungal community datasets by ecological guild. Fungal Ecology 20:241-248.
MicroPITA分析
在做完16S、18S或ITS等微生物多樣性研究后，我們常常還會想進(jìn)一步了解微生物群落的功能。通常情況下，會采用宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組或宏代謝組等方法深入分析，但相對于擴(kuò)增子測序，宏基因組等測序手段的價(jià)格還是相對較高，因此需要從已測完的樣本中再挑選合適的樣本進(jìn)行宏基因組測序?？衫胢icroPITA進(jìn)行樣品預(yù)測，挑選出合適的樣品。該分析是基于大量微生物多樣性的數(shù)據(jù)，根據(jù)不同指標(biāo)篩選出代表性樣本，以便于開展開展后續(xù)研究。
| 類型 |
方法 |
含義 |
樣本特點(diǎn) |
| 無監(jiān)督方法 |
diverse |
選擇α多樣性最高的樣本 |
生態(tài)多樣性高 |
| features |
根據(jù)目標(biāo)物種挑選樣本 |
針對特定物種 |
| extreme |
選擇β多樣性距離最遠(yuǎn)的樣本 |
極端樣本 |
| representative |
最能反映整體距離差異的樣本 |
核心樣本 |
| 有監(jiān)督方法 |
Distinct |
根據(jù)表型/分組特征，挑選組間β多樣性距離最大的樣本 |
依據(jù)表型/分組特征，選擇極端樣本 |
| Discriminant |
根據(jù)表型/分組特征，挑選離分組中心最近的樣本 |
依據(jù)表型/分組特征，挑選核心樣本 |
參考文獻(xiàn)：Tickle TL, Segata N, Waldron L, Weingart U, Huttenhower C. Two-stage microbial community experimental design. ISME J. 2013 Dec;7(12):2330-9. doi: 10.1038/ismej.2013.139. Epub 2013 Aug 15. PMID: 23949665; PMCID: PMC3834858.
群落結(jié)構(gòu)分析
微生物群落生態(tài)學(xué)的一個(gè)主要目標(biāo)是了解構(gòu)成跨時(shí)空物種豐度模式的過程。確定性和隨機(jī)性兩種類型的過程會影響群落的聚集。確定性過程與生態(tài)選擇相關(guān)，隨機(jī)過程包括不可預(yù)測的擾動、概率性的散布和隨機(jī)的出生-死亡事件等，這些變化不是由環(huán)境決定的適應(yīng)性結(jié)果。通過零模型量化群落的絕對系統(tǒng)發(fā)育距離與隨機(jī)系統(tǒng)發(fā)育距離的偏離度，偏離程度越大，群落受確定性因素的影響越大，偏離度越小，群落受隨機(jī)性因素的影響越大。通常使用βNTI（最近種間親緣關(guān)系指數(shù)）以評估不同時(shí)空尺度下隨機(jī)性和確定性過程對微生物群落組裝的影響。
其中，| βNTI |>2表示觀察到的兩個(gè)群落之間的更替主要由選擇控制，其中βNTI>+2與變量選擇一致，而βNTI<-2表示同質(zhì)選擇。因此，| βNTI |<2意味著一組群落的更替受擴(kuò)散限制、均勻化擴(kuò)散或未消除過程的控制。為了理清這些過程，Raup-Crick矩陣（RCbray）基于群落的標(biāo)準(zhǔn)Bray-Curtis矩陣構(gòu)建，提供有關(guān)所觀察到的流動程度是否明顯偏離預(yù)期的信息。這個(gè)值等于觀測到的Bray-Curtis和零分布之間的偏差，范圍是-1到+1。| RCbray |<0.95可以解釋為終止過程的影響。反過來，擴(kuò)散限制加上漂移導(dǎo)致大于預(yù)期的周轉(zhuǎn)率（RCbray>+0.95），而RCbray<-0.95則表明群落組成的周轉(zhuǎn)率主要受均勻擴(kuò)散控制。
參考文獻(xiàn)：Jizhong, Zhou, Daliang, et al. Stochastic Community Assembly: Does It Matter in Microbial Ecology[J]. Microbiology & Molecular Biology Reviews, 2017.
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